Les cellules basales comme cellules souches de la trachée de la souris et de l’épithélium des voies respiratoires humaines

Résultats et discussion

Traçage in vivo du lignage des BC de la trachée de la souris.

Le traçage antérieur du lignage des BC de la trachée de la souris après une blessure utilisait un transgène KRT14-CreER (8). Cependant, cet allèle est inefficace pour marquer les BCs en état stable. Nous avons donc créé une nouvelle lignée dans laquelle un promoteur de kératine 5 humaine (KRT5) de 6 kb conduit CreERT2 (Fig. 1A). Nous avons utilisé cet allèle, en combinaison avec le rapporteur Rosa26R-lacZ, pour tracer la lignée des CB chez les souris adultes jusqu’à 14 semaines (Fig. 1B). Peu de temps après la dernière injection de tamoxifène (Tmx), la plupart des cellules marquées (≈98%) ont été marquées comme étant des BCs (Fig. 1C). Au fil du temps, le pourcentage de cellules marquées classées comme BCs a diminué, tandis que celui des cellules sécrétoires et ciliées marquées a augmenté (Fig. 1 D-F et Tableau 1). Les BCs marquées par le lignage donnent naissance à plus de Clara que de cellules ciliées au cours de la période de poursuite. Il y a deux explications possibles à ce résultat. Premièrement, les CB peuvent donner naissance à des cellules de Clara plus fréquemment que les cellules ciliées, peut-être parce que ces dernières ont une demi-vie plus longue que les cellules de Clara et doivent être remplacées moins souvent. Il se peut aussi que les CB donnent d’abord naissance à des cellules de Clara, qui se transforment ensuite lentement en cellules ciliées. Nous privilégions actuellement le second modèle car il est soutenu par des expériences de pulse-chase de thymidine tritiée chez le rat (1) et par nos propres études de marquage de lignage par pulse-chase avec des cellules Scgb1a1-CreER+ (Clara) dans la trachée de la souris (13).

Au cours de la croissance postnatale, il y a une augmentation de la longueur et du diamètre de la trachée des rongeurs et du nombre de cellules épithéliales, y compris les BC (1). Dans des études précédentes, nous avons montré le marquage au BrdU des cellules épithéliales de la trachée à 6 jours postnatals (P)6, P3 semaines et P6 mois (13). Une analyse plus approfondie du matériel a démontré que 55% des BCs p63+ et 10% des non-BCs sont marqués au BrdU à P6 jours, alors que les valeurs correspondantes pour P3 semaines étaient de 9% des BCs et 2% des non-BCs (Fig. S1). Pour suivre le comportement des BCs trachéales pendant la croissance postnatale, une cohorte de souris KRT5-CreERT2;Rosa26R-eYFP a reçu une impulsion de Tmx à P10 jours ou P12 jours (Fig. 1G). A P3 semaines, la majorité (96%) des cellules marquées par le lignage étaient des BCs (Fig. 1H et Tableau S1). Elles représentaient 7 % ± 3 % de toutes les BC dans la trachée (tableau S2). Ce pourcentage est resté approximativement le même lorsque les membres de la cohorte ont été examinés à P6 semaines et à P15 semaines, ce qui suggère que les BCs marquées s’auto-renouvellent et ne sont pas diluées par les descendants des cellules non marquées. Comme précédemment, il y a eu une augmentation dans le temps du pourcentage de cellules marquées classées comme cellules de Clara ou ciliées (Fig. 1I et Tableau S1). Ainsi, au cours de la croissance postnatale, les cellules biliaires s’auto-renouvellent et donnent naissance à des cellules clara et ciliées.

Enfin, nous avons suivi le destin des cellules biliaires marquées dans un modèle de réparation. L’inhalation de SO2 entraîne des dommages importants de l’épithélium trachéal, suivis d’une prolifération des cellules survivantes et d’une restauration de l’histologie normale au bout de 2 semaines (14). Au cours du processus de réparation, les BCs marquées prolifèrent et donnent naissance à des plaques relativement grandes de descendants qui incluent des cellules de Clara et des cellules ciliées (Fig. S2). Contrairement aux résultats obtenus à l’état d’équilibre, les CB répondant à une blessure donnent naissance à plus de cellules ciliées que de cellules de Clara au cours de la même période (Tableau 1). Ceci suggère que les destins des filles des CB peuvent varier en réponse aux conditions locales.

Profil transcriptionnel des BCs trachéales.

Pour séparer les BCs des cellules cylindriques pour le profilage transcriptionnel, nous avons d’abord trié les cellules sur la base de la liaison de l’isolectine A3B de Griffonia simplicifolia marquée par fluorescence (GSI-A3B), qui se lie à toutes les BCs (3, 10, 15). Elle se lie également à une population de cellules dendritiques présentes dans l’épithélium (16). Nous avons purifié les cellules lectines+ sur la base de l’expression de la GFP en utilisant une lignée de souris transgéniques KRT5-GFP décrite précédemment, dans laquelle la GFP est exprimée à des niveaux élevés dans environ 60% des BCs trachéaux p63+ (3). Les cellules lectin+;KRT5-GFP+ (P4) constituaient une sous-population essentiellement pure de BCs car >90% expriment p63. En revanche, la population lectin-;KRT5-GFP- (ci-après, non-BC) (P5) contenait très peu de cellules p63+. Les cellules lectin+;KRT5-GFP- (P6) contenaient des cellules basales et dendritiques (Fig. 2 A et B).

L’ARN des 3 fractions a été analysé par microarray Affymetrix. Le regroupement des 100 gènes les plus régulés de manière différentielle entre les fractions a montré une bonne corrélation entre les réplicats (figure 2C). Les gènes les plus fortement exprimés dans la population non-BC comprenaient ceux associés aux cellules ciliées et sécrétoires (Tableau S3). Comme prévu, certains des gènes régulés dans la population lectine+;KRT5-GFP- sont associés aux cellules dendritiques. A l’avenir, de nouvelles stratégies seront utilisées pour éliminer les cellules dendritiques de cette fraction BC. Nous avons trouvé 627 gènes régulés au moins 21,5 fois dans les BCs lectin+;KRT5-GFP+ par rapport aux non-BCs (P ≤ 0,001) (Tableau S4 et Tableau S5). La validité de l’écran a été confirmée de plusieurs façons. Premièrement, la RT-PCR a confirmé l’enrichissement des transcrits dans les BCs KRT5-GFPhi (Fig. 2D). Deuxièmement, des rapports publiés ont confirmé l’expression de plusieurs gènes enrichis dans les BCs de la trachée murine et/ou des voies respiratoires humaines. Il s’agit par exemple des gènes codant pour Trp-63, qui est nécessaire au développement des BC dans la trachée de la souris (2), Snai2, Cd109, claudine 1, Icam1, aquaporine 3 et kératines 5, 14 et 17 (3, 17-21). Enfin, l’immunohistochimie sur des sections de trachée de souris et de bronches humaines normales a confirmé l’expression des BC de plusieurs gènes, dont Ngfr (voir ci-dessous).

Les gènes régulés à la hausse dans les BC lectin+;KRT5-GFPhi ont été classés en catégories fonctionnelles (tableau S4). Ceux associés à l’adhésion cellulaire comprennent les gènes codant pour les composants des hémidesmosomes et des fibrilles d’ancrage – intégrines α6 et β4, laminines α3 et β3, dystonine (BPAG1) et collagène 17a1 (BPAG2) (22). Ceci reflète les attaches hémidesmosomales abondantes des BCs à la lamina basale sous-jacente (1). Nos résultats suggèrent également que les BCs produisent des composants de l’ECM, y compris la fibuline1, la fibrilline2, le Tnc, le collagène18a1, le Sparc, et le TGFβ-induit. Ils sont également enrichis en composants du cytosquelette qui influencent l’organisation, la forme et la motilité de la membrane. Les facteurs de transcription qui sont régulés à la hausse dans les BCs KRT5-GFP+ comprennent Snai2 (Slug) et son corépresseur, ajuba (Jub), basonuclin, Lmo1, Tbx2, Barx2, Etv4, Hlf, AP-2 epsilon, Myc, et Ascl2.

Les BCs trachéaux sont normalement relativement quiescents mais répondent rapidement aux blessures. La quiescence et l’activation sont probablement régulées par une signalisation réciproque entre les BC et leur niche. Les transcrits de divers ligands de signalisation (Bmp7, delta-like 1 et 2, jagged2, Ccl20, PdgfC, pleiotrophine, Tgfb1, Ntf3, Wnt3a, Wnt5b et Wnt9a) et de récepteurs (Notch1, Gfra1, Ngfr, Ptch2, Egfr, Tgfbr3, récepteur d’éphrine B4 et plusieurs récepteurs couplés aux protéines G) étaient enrichis dans cette sous-population de CB. En outre, les antagonistes des voies de signalisation intercellulaire (Socs3, sprouty1, Sfrp1, Dkk3, follistatine-like1, follistatine-like3, Ppp2r2c, et la protéine 4 de liaison au TGFβ latent) étaient également régulés à la hausse.

La réponse proliférative rapide des BC aux lésions épithéliales suggère que, bien qu’ils soient normalement relativement quiescents, ils sont prêts à répondre à des stimuli activateurs. Cette caractéristique n’est pas propre aux cellules bovines respiratoires. Par exemple, les cellules souches dans les systèmes qui subissent des cycles de croissance, de destruction, de repos et de repousse (par exemple, la glande mammaire et le follicule pileux) subissent des changements phénotypiques similaires de la quiescence à l’activation. Il est donc très intéressant de constater qu’un certain nombre de gènes exprimés dans les cellules souches du bulbe du follicule pileux et de la glande mammaire, y compris des facteurs de transcription, des composants de l’ECM, des ligands de signalisation, des récepteurs et, surtout, des régulateurs négatifs de la signalisation intercellulaire, sont également exprimés dans les BC trachéales (23, 24). Beaucoup de ces protéines contrôlent probablement les interactions entre les cellules souches et les niches et, potentiellement, la capacité des CB à répondre aux stimuli d’activation.

Le fait que les CB génèrent des proportions différentes de cellules ciliées et de cellules de Clara à l’état stable par rapport à la réparation après une blessure (tableau 1) suggère que les destins des cellules de la progéniture sont influencés par les conditions tissulaires locales. Ce concept a été proposé pour l’intestin moyen de la drosophile, où des niveaux variables de ligand Notch dans les cellules souches intestinales régulent le devenir de leur progéniture (25, 26). De manière significative, les CB sont enrichis en transcrits de la voie Notch (par exemple, Notch1, Dll1, et Jag2). Des études futures détermineront leur fonction dans les BCs.

Nouveau test pour l’auto-renouvellement et la différenciation des BCs.

Les tests précédents pour le potentiel de prolifération et de différenciation des BCs trachéaux incluent la repopulation de xénogreffes trachéales dénudées et la culture en interface air-liquide (ALI). Aucune de ces méthodes n’est idéale pour une analyse quantitative, car les modèles de xénogreffes ont un faible débit, et nous avons trouvé qu’il était difficile de différencier de manière reproductible les cellules souches de la trachée au niveau de l’interface air-liquide en l’absence de cellules non souches. Nous avons donc adapté les essais de formation de sphères tridimensionnelles d’autres populations de cellules souches pour l’expansion et la différenciation des cellules souches bovines. Lorsque des cellules souches trachéales KRT5-GFP+ uniques et viables ont été ensemencées dans cet essai, des  » trachéosphères  » avec une lumière visible se sont formées en une semaine, même en l’absence de stroma ou de cellules non souches (Fig. 3 A et B). L’efficacité de la formation de sphères était de ≈3% des cellules KRT5-GFP+ placées. En comparaison, l’efficacité de formation de colonies de cellules KRT5-GFP+ dans une culture ALI bidimensionnelle en combinaison avec un excès de 500 fois de cellules KRT5-GFP- était de 5% (3). Environ 0,5 % des cellules KRT5-GFP-, probablement des BC KRT5-GFP-, ont formé des sphères histologiquement indiscernables des sphères dérivées des BC KRT5-GFP+ (Fig. 3C et Tableau S6).

Après 9 jours de culture, nous avons observé des trachéosphères avec des diamètres allant de <50 μm à >300 μm, ce qui suggère qu’il existe une hétérogénéité au sein de la population formant des sphères (Fig. S3 et Tableau S7). Rarement, des colonies lobées ont été observées, mais ces colonies n’ont pas survécu sur le long terme et ont donc une capacité limitée d’auto-renouvellement dans cet essai. Au jour 9, les trachéosphères étaient constituées d’un épithélium pseudostratifié avec des BC p63+, KRT14+ périphériques aux cellules luminales KRT8+ (Fig. 3 D et E). Au jour 20, les sphères survivantes avaient subi une expansion luminale et un amincissement de l’épithélium pseudostratifié, et des cils battants ont été observés. Ceci a été confirmé par la coloration par anticorps de la tubuline acétylée (Fig. 3G). Dans les sphères de 26 jours, le pourcentage de cellules cylindriques KRT8+ qui étaient ciliées (≈50 %) était approximativement le même que dans les trachées de souris adultes de type sauvage. Les cellules KRT8+ non ciliées ont persisté dans les sphères mais n’ont pas exprimé les marqueurs des cellules de Clara (Scgb1a1), neuroendocrines (CGRP) ou productrices de mucus (Muc5AC) à des niveaux détectables par immunohistochimie à 9 ou 20 jours de culture. En outre, très peu de cellules exprimaient la claudine 10. D’autres expériences sont nécessaires pour identifier ce type de cellules colonnaires et pour optimiser les conditions de différenciation des cellules sécrétrices matures à partir des progéniteurs des CB. Les BCs dans les sphères ont maintenu l’expression de la KRT5-GFP au moins jusqu’à P21 jours. Pour démontrer davantage le potentiel d’auto-renouvellement des BC, nous avons sous-cultivé en série les cellules KRT5-GFP+ des sphères à deux reprises au moment de la soumission.

Pour une large application du test de la trachéosphère, il est important de pouvoir isoler les BC indépendamment de tout transgène. Notre analyse du transcriptome a révélé que Ngfr (p75, Tnfrsf16), un membre de la superfamille des récepteurs du TNF, est enrichi dans les BC trachéens (Tableau S4). De manière significative, ce gène est également exprimé dans les cellules basales/semblables à des cellules basales d’autres épithéliums, y compris l’œsophage, le limbe cornéen et la glande mammaire (28-30). Le gène Ntf3, codant pour un ligand du NGFR, est également enrichi dans les cellules de la trachée de la souris (tableau S5), ce qui laisse supposer l’existence d’une signalisation autocrine au sein de cette population. L’immunohistochimie a montré que le NGFR est spécifiquement localisé dans 98% des BCs de souris p63+ (Fig. 4A). Nous avons donc utilisé un anticorps NGFR pour trier les cellules épithéliales trachéales en populations basales et non basales (Fig. 4B). Après FACS, 86% des cellules NGFR+ étaient p63+, alors que <1% des cellules NGFR- expriment p63. L’efficacité de formation de sphères des BC NGFR+ était de ≈4 %, alors que ≈0,05 % des cellules NGFR- ont donné naissance à des sphères (tableau S6). Ce résultat suggère que, bien qu’un sous-ensemble de BC soit capable de s’auto-renouveler et de se différencier dans ces conditions, la capacité des populations appauvries en BC à le faire est considérablement réduite. En fait, étant donné que 4 % des BC génèrent des sphères et que ≈1 % des cellules NGFR- sont des BC p63+, l’efficacité de formation de sphères de 0,05 % dans la population NGFR- est potentiellement attribuable aux BC. Les sphères dérivées des cellules NGFR+ étaient histologiquement les mêmes que celles dérivées des cellules KRT5-GFP+. De plus, lorsque les cellules NGFR+ de souris exprimant la GFP constitutive ou la RFP ont été mélangées après le tri, toutes les sphères ont émis une fluorescence rouge ou verte (Fig. S3D). Ce résultat suggère que les sphères sont dérivées de BCs NGFR+ uniques.

BCs du poumon humain.

Chez les humains, les cellules p63+ avec la morphologie des BCs sont trouvées dans tout le poumon, bien que leur nombre diminue de façon distale (1, 4, 5). Ces cellules expriment un certain nombre de gènes enrichis dans les BCs de souris, y compris NGFR (Fig. 4C). Pour appliquer notre test in vitro aux cellules cancéreuses humaines, nous avons isolé les cellules épithéliales totales des bronches humaines et les avons mises en culture pendant une nuit afin d’enrichir les cellules p63+. Notre analyse transcriptomique des CB de souris a montré que Itga6 est exprimé de manière préférentielle dans les CB de la trachée. Nous avons donc trié les cellules épithéliales pulmonaires humaines par FACS en utilisant les anticorps NGFR et ITGA6 (Fig. 4D). Dans ces conditions, ≈96% de la fraction ITGA6+;NGFR+ était p63+, alors que seulement ≈15% des cellules ITGA6-;NGFR- exprimaient p63. Lorsqu’elles ont été ensemencées dans le test, les BC ITGA6+;NGFR+ ont donné naissance à des  » bronchosphères  » au 10e jour, avec une seule lumière qui a subi une expansion pendant 20 jours de culture (figure 4 E-I et tableau S8). Très peu de colonies se sont formées à partir des cellules ITGA6-;NGFR-. Les sphères contenaient des BCs KRT14+, p63+ périphériques aux cellules luminales KRT8+, et des cellules ciliées ont été observées dans les 25 jours de culture. Ces résultats suggèrent que les BCs humaines sont capables à la fois de s’auto-renouveler et de générer des filles différenciées.

En conclusion, nous avons démontré in vivo que les BCs de la trachée de la souris fonctionnent comme des cellules progénitrices à la fois pendant la croissance postnatale et chez l’adulte à l’état stable et dans un modèle de réparation. En utilisant un test clonal, nous avons montré que les cellules souches de la trachée de la souris et de l’homme peuvent s’auto-renouveler et se différencier en l’absence de stroma ou de cellules épithéliales colonnaires. Ce test facilitera l’étude des mécanismes régulant le développement, la maintenance et la réparation de l’épithélium des voies respiratoires. Enfin, nous avons dérivé un profil transcriptionnel des BCs de souris qui informera les futures investigations sur le contrôle phénotypique de cette importante population de cellules souches dans le développement normal et la maladie.