Cellule basali come cellule staminali della trachea del topo e dell’epitelio delle vie aeree umane

Risultati e discussione

Tracciamento del lignaggio in vivo delle BC tracheali del topo.

Il precedente tracciamento del lignaggio delle BC tracheali del topo dopo le lesioni ha usato un transgene KRT14-CreER (8). Tuttavia, questo allele è inefficiente per l’etichettatura BCs in stato stazionario. Abbiamo quindi fatto una nuova linea in cui un 6-kb umano cheratina 5 (KRT5) promotore guida CreERT2 (Fig. 1A). Abbiamo usato questo allele, in combinazione con il Rosa26R-lacZ reporter, per lineage traccia BCs in topi adulti per un massimo di 14 settimane (Fig. 1B). Subito dopo l’ultima iniezione di tamoxifene (Tmx), la maggior parte delle cellule etichettate (≈98%) sono stati contrassegnati come BCs (Fig. 1C). Nel corso del tempo, la percentuale di cellule etichettate segnato come BCs diminuito, mentre quella delle cellule secretorie etichettati e ciliato aumentato (Fig. 1 D-F e Tabella 1). Lineage etichettati BCs dare origine a più Clara di cellule ciliate nel corso del periodo di inseguimento. Ci sono 2 possibili spiegazioni per questo risultato. In primo luogo, BCs può dare origine a cellule Clara più frequentemente di cellule ciliate-possibilmente perché questi ultimi hanno una più lunga emivita di cellule Clara e devono essere sostituiti meno spesso. In alternativa, le BC prima danno origine a cellule Clara, che poi lentamente si trasformano in cellule ciliate. Attualmente favoriamo il secondo modello perché è supportato da esperimenti di timidina triziata in fase di pulsazione nel ratto (1) e dai nostri studi di etichettatura del lineage in fase di pulsazione con cellule Scgb1a1-CreER+ (Clara) nella trachea del topo (13).

Durante la crescita postnatale c’è un aumento della lunghezza e del diametro della trachea dei roditori e del numero di cellule epiteliali, comprese le BC (1). In studi precedenti abbiamo mostrato l’etichettatura BrdU delle cellule epiteliali tracheali a postnatale (P)6 giorni, P3 settimane, e P6 mesi (13). Ulteriori analisi del materiale ha dimostrato che il 55% di p63 + BCs e 10% dei non-BCs sono BrdU etichettati a P6 giorni, mentre i valori corrispondenti per P3 settimane erano 9% di BCs e 2% dei non-BCs (Fig. S1). Per seguire il comportamento delle BC tracheali durante la crescita postnatale una coorte di KRT5-CreERT2; Rosa26R-eYFP topi è stato dato un impulso di Tmx a P10 giorni o P12 giorni (Fig. 1G). A P3 settimane, la maggior parte (96%) delle cellule etichettati lignaggio erano BCs (Fig. 1H e Tabella S1). Questi rappresentavano 7% ± 3% di tutti i BCs nella trachea (Tabella S2). Questa percentuale è rimasta approssimativamente la stessa quando i membri della coorte sono stati esaminati a P6 settimane e a P15 settimane, suggerendo che etichettati BCs auto-rinnovarsi e non sono diluiti da discendenti di cellule non etichettati. Come prima, c’era un aumento nel tempo nella percentuale di cellule etichettate segnato come Clara o cellule ciliate (Fig. 1I e Tabella S1). Così, durante la crescita postnatale BCs sia auto-rinnovarsi e dare origine a Clara e cellule ciliate.

Infine, abbiamo seguito i destini di BCs etichettati in un modello di riparazione. Inalazione di SO2 porta a danni estesi dell’epitelio tracheale, seguita dalla proliferazione delle cellule sopravvissute e il ripristino della normale istologia da 2 settimane (14). Durante il processo di riparazione, etichettato BCs proliferare e dare origine a patch relativamente grande di discendenti che includono Clara e cellule ciliate (Fig. S2). In contrasto con i risultati allo stato stazionario, BCs rispondendo a lesioni dare origine a più ciliato di cellule Clara nello stesso periodo (Tabella 1). Questo suggerisce che i destini di figlie BC può variare in risposta alle condizioni locali.

Profilo trascrizionale di BCs tracheale.

Per separare BCs da cellule colonnari per il profilo trascrizionale, abbiamo prima ordinato le cellule sulla base del legame di isolectin A3B Griffonia simplicifolia marcato fluorescentemente (GSI-A3B), che si lega tutti BCs (3, 10, 15). Si lega anche una popolazione di cellule dendritiche presenti all’interno dell’epitelio (16). Abbiamo ulteriormente purificato le cellule lectina + sulla base di espressione di GFP utilizzando un precedentemente descritto KRT5-GFP linea di topo transgenico in cui GFP è espresso ad alti livelli in circa il 60% di p63 + BCs tracheale (3). La lectina +; KRT5-GFP + cellule (P4) erano una sottopopolazione essenzialmente pura BC perché >90% esprimere p63. Al contrario, la popolazione lectin-;KRT5-GFP- (di seguito, non-BC) (P5) conteneva pochissime cellule p63+. Le cellule lectin+;KRT5-GFP- (P6) contenevano sia cellule basali che dendritiche (Fig. 2 A e B).

RNA da tutte le 3 frazioni è stato analizzato da Affymetrix microarray. Clustering dei 100 geni più differenzialmente regolati tra le frazioni ha mostrato una buona correlazione tra i replicati (Fig. 2C). I geni più altamente espressi nella popolazione non-BC includevano quelli associati alle cellule ciliate e secretorie (Tabella S3). Come previsto, alcuni dei geni upregolati nella popolazione lectina+;KRT5-GFP- sono associati alle cellule dendritiche. In futuro, nuove strategie saranno utilizzate per rimuovere le cellule dendritiche da questa frazione BC. Abbiamo trovato 627 geni upregolati almeno 21.5-fold nella lectina +; KRT5-GFP + BCs rispetto ai non-BCs (P ≤ 0.001) (Tabella S4 e Tabella S5). La validità dello schermo è stato confermato in diversi modi. In primo luogo, RT-PCR confermato l’arricchimento di trascrizioni in KRT5-GFPhi BCs (Fig. 2D). In secondo luogo, i rapporti pubblicati confermato l’espressione di diversi geni arricchiti in BCs di trachea murina e / o vie aeree umane. Esempi includono i geni che codificano Trp-63, che è richiesto per lo sviluppo BC nella trachea del mouse (2), Snai2, Cd109, claudin 1, Icam1, aquaporin 3, e cheratine 5, 14 e 17 (3, 17-21). Infine, immunoistochimica su sezioni di trachea di topo e normale bronco umano confermato BC espressione di diversi geni, tra cui Ngfr (vedi sotto).

I geni upregolati in lectina +; KRT5-GFPhi BCs sono stati ordinati in categorie funzionali (Tabella S4). Quelli associati con l’adesione cellulare includono geni che codificano i componenti di emidesmosomi e fibrille di ancoraggio-integrine α6 e β4, laminine α3 e β3, dystonin (BPAG1) e collagene 17a1 (BPAG2) (22). Questo riflette gli abbondanti attacchi emidesmosomici di BCs alla lamina basale sottostante (1). I nostri risultati suggeriscono anche che BCs producono componenti della ECM, tra cui fibulin1, fibrillin2, Tnc, collagene18a1, Sparc, e TGFβ indotta. Essi sono anche arricchiti per i componenti citoscheletrici che influenzano l’organizzazione della membrana, la forma e la motilità. I fattori di trascrizione che sono upregolati in KRT5-GFP + BCs includono Snai2 (Slug) e il suo corepressore, ajuba (Jub), basonuclin, Lmo1, Tbx2, Barx2, Etv4, Hlf, AP-2 epsilon, Myc, e Ascl2.

Le BC tracheali sono normalmente relativamente quiescenti ma rispondono rapidamente alle lesioni. Sia la quiescenza che l’attivazione sono probabilmente regolati dalla segnalazione reciproca tra BCs e la loro nicchia. Trascrizioni per vari ligandi di segnalazione (Bmp7, delta-like 1 e 2, jagged2, Ccl20, PdgfC, pleiotrophin, Tgfb1, Ntf3, Wnt3a, Wnt5b, e Wnt9a) e recettori (Notch1, Gfra1, Ngfr, Ptch2, Egfr, Tgfbr3, recettore ephrin B4, e diversi recettori accoppiati alle proteine G) erano arricchiti in questa sottopopolazione BC. Inoltre, antagonisti delle vie di segnalazione intercellulare (Socs3, sprouty1, Sfrp1, Dkk3, follistatin-like1, follistatin-like3, Ppp2r2c e latente TGFβ binding protein 4) erano anche upregulated.

La rapida risposta proliferativa di BC a lesioni epiteliali suggerisce che, anche se sono normalmente relativamente quiescente, essi sono pronti a rispondere a stimoli attivanti. Questa caratteristica non è unica per BCs respiratoria. Per esempio, le cellule staminali nei sistemi che subiscono cicli di crescita, distruzione, riposo e ricrescita (ad esempio, la ghiandola mammaria e follicolo pilifero) subiscono simili interruttori fenotipici da quiescenza all’attivazione. È quindi di grande interesse che un certo numero di geni espressi nelle cellule staminali del bulge follicolo pilifero e ghiandola mammaria, compresi i fattori di trascrizione, componenti della ECM, ligandi di segnalazione, recettori e, soprattutto, regolatori negativi di segnalazione intercellulare, sono espressi anche in BCs tracheale (23, 24). Molte di queste proteine probabilmente controllo cellule staminali-niche interazioni e, potenzialmente, la capacità di BCs per rispondere a stimoli attivanti.

Il fatto che BCs generare diverse proporzioni di cellule ciliate e Clara allo stato stazionario vs riparazione dopo la lesione (Tabella 1) suggerisce che i destini delle cellule progenie sono influenzati dalle condizioni del tessuto locale. Questo concetto è stato proposto per il midgut di Drosophila, dove vari livelli di ligando Notch nelle cellule staminali intestinali regola i destini della loro progenie (25, 26). Significativamente, BCs sono arricchiti per trascrizioni del percorso Notch (ad esempio, Notch1, Dll1 e Jag2). Studi futuri determineranno la loro funzione in BCs.

Nuovo saggio per l’auto-rinnovamento e la differenziazione di BCs.

Precedenti saggi per il potenziale di BCs tracheale a proliferare e differenziare includono ripopolamento di xenotrapianti tracheali denudato e aria-liquido interfaccia (ALI) cultura. Nessuno dei due è ideale per l’analisi quantitativa perché i modelli di xenotrapianto sono low-throughput, e abbiamo trovato difficile riproducibile differenziare BCs al ALI in assenza di non-BCs. Abbiamo quindi adattato 3-dimensionale sfera formando saggi da altre popolazioni di cellule staminali per l’espansione e la differenziazione di BCs. Quando singolo, vitale KRT5-GFP + BC tracheale sono stati seminati in questo saggio, “tracheosfere” con un lume visibile formato entro 1 settimana, anche in assenza di stroma o non-BCs (Fig. 3 A e B). L’efficienza di formazione delle sfere era ≈3% delle cellule KRT5-GFP+ piastrate. In confronto, l’efficienza di formazione di colonie di cellule KRT5-GFP+ in coltura bidimensionale ALI in combinazione con un eccesso di 500 volte di cellule KRT5-GFP- era del 5% (3). Circa 0,5% delle cellule KRT5-GFP-, probabilmente KRT5-GFP- BCs, formato sfere istologicamente indistinguibili dal KRT5-GFP + BC-derivato sfere (Fig. 3C e Tabella S6).

Per 9 giorni di cultura, abbiamo osservato tracheosfere con diametri che vanno da <50 μm a >300 μm, suggerendo che l’eterogeneità esiste all’interno della sfera-formazione della popolazione (Fig. S3 e Tabella S7). Raramente, colonie lobate sono stati osservati, ma queste colonie non sopravvivono a lungo termine e quindi hanno limitata capacità di auto-rinnovamento in questo saggio. Entro il giorno 9, tracheospheres consisteva in un epitelio pseudostratificato con p63 +, KRT14 + BCs periferico al luminal KRT8 + cellule (Fig. 3 D e E). Entro il giorno 20, le sfere sopravvissute avevano subito l’espansione luminale e un assottigliamento dell’epitelio pseudostratificato, e ciglia battenti sono stati osservati. Questo è stato confermato dalla colorazione anticorpale per la tubulina acetilata (Fig. 3G). Nelle sfere di 26 giorni la percentuale di cellule colonnari KRT8+ che erano ciliate (≈50%) era approssimativamente la stessa che nelle trachee di topi adulti wild-type. Le cellule KRT8+ non ciliate persistevano nelle sfere, ma non esprimevano marcatori di cellule Clara (Scgb1a1), neuroendocrine (CGRP) o produttrici di muco (Muc5AC) a livelli rilevabili dall’immunoistochimica a 9 o 20 giorni di cultura. Inoltre, pochissime cellule hanno espresso la claudina 10. Ulteriori esperimenti sono necessari per identificare questo tipo di cellule colonnari e per ottimizzare le condizioni per la differenziazione delle cellule secretorie mature da progenitori BC. BC in sfere mantenuto l’espressione di KRT5-GFP almeno fino a P21 giorni. Per dimostrare ulteriormente il potenziale di auto-rinnovamento di BCs, abbiamo serialmente subculturato cellule KRT5-GFP + da sfere due volte al momento della presentazione.

Per un’ampia applicazione del saggio tracheosphere, è importante essere in grado di isolare BCs indipendentemente da qualsiasi transgene. La nostra analisi del trascrittoma ha rivelato che Ngfr (p75, Tnfrsf16), un membro della superfamiglia del recettore TNF, è arricchito in BCs tracheale (Tabella S4). Significativamente, questo gene è anche espresso in basale / basale-come le cellule di altri epiteli, tra cui esofago, limbus corneale, e ghiandola mammaria (28-30). Ntf3, che codifica un ligando per NGFR, è anche arricchito in topo tracheale BCs (Tabella S5), sollevando la possibilità di segnalazione autocrina all’interno di questa popolazione. Immunoistochimica ha mostrato che NGFR è specificamente localizzato al 98% di p63 + topo BCs (Fig. 4A). Abbiamo quindi usato un anticorpo NGFR per ordinare le cellule epiteliali tracheali in popolazioni basali e non basali (Fig. 4B). Dopo FACS, l’86% delle cellule NGFR + erano p63 +, mentre <1% delle cellule NGFR- esprimono p63. L’efficienza di formazione di sfere di NGFR + BCs era ≈4%, mentre ≈0.05% NGFR- cellule ha dato origine a sfere (Tabella S6). Questo risultato suggerisce che anche se un sottoinsieme di BC è in grado di auto-rinnovare e differenziare in queste condizioni, la capacità delle popolazioni impoverito BC a farlo è significativamente ridotto. Infatti, perché il 4% di BCs generare sfere e ≈1% delle cellule NGFR- sono p63 + BCs, lo 0,05% sfera-forming efficienza nella popolazione NGFR- è potenzialmente attribuibile a BCs. Le sfere derivate dalle cellule NGFR+ erano istologicamente le stesse di quelle derivate dalle cellule KRT5-GFP+. Inoltre, quando NGFR + BCs da costitutivamente GFP-esprimendo o RFP-esprimendo i topi sono stati mescolati dopo l’ordinamento, tutte le sfere sono diventati rosso o verde (Fig. S3D). Questo risultato suggerisce che le sfere sono derivati da singoli NGFR + BCs.

BCs del polmone umano.

Negli esseri umani, p63 + cellule con la morfologia di BCs si trovano in tutto il polmone, anche se il numero diminuisce distalmente (1, 4, 5). Queste cellule esprimono una serie di geni arricchiti in topo BCs, tra cui NGFR (Fig. 4C). Per applicare il nostro test in vitro per BCs umano, abbiamo isolato le cellule epiteliali totali da bronchi umani e coltivate durante la notte per arricchire le cellule p63 +. La nostra analisi trascrittoma di topo BCs ha mostrato che Itga6 è preferenzialmente espresso in BCs tracheale. Abbiamo quindi ordinato le cellule epiteliali polmonari umane da FACS utilizzando NGFR e ITGA6 anticorpi (Fig. 4D). In queste condizioni, ≈96% della frazione ITGA6 +; NGFR + era p63 +, mentre solo ≈15% delle cellule ITGA6-;NGFR- espresso p63. Quando seminato nel test, ITGA6 +; NGFR + BCs ha dato origine a “bronchospheres” dal giorno 10, con un unico lume che ha subito l’espansione oltre 20 giorni di cultura (Fig. 4 E-I e Tabella S8). Molto poche colonie formato dal ITGA6-;NGFR- cellule. Sfere contenute KRT14 +, p63 + BCs periferico a KRT8 + cellule luminali, e cellule ciliate sono stati osservati entro 25 giorni di cultura. Questi risultati suggeriscono che le BC umane sono in grado sia di auto-rinnovamento e la generazione di figlie differenziate.

In conclusione, abbiamo dimostrato in vivo che BCs della trachea del mouse funzione come cellule progenitrici sia durante la crescita postnatale e nell’adulto allo stato stazionario e in un modello di riparazione. Utilizzando un saggio clonale, abbiamo dimostrato che BCs di entrambe le vie aeree topo e umano può auto-rinnovare e differenziare in assenza di stroma o cellule epiteliali colonnari. Questo test faciliterà lo studio dei meccanismi che regolano lo sviluppo, la manutenzione e la riparazione dell’epitelio delle vie aeree. Infine, abbiamo derivato un profilo trascrizionale di topo BCs che informerà future indagini sul controllo fenotipico di questa importante popolazione di cellule staminali sia nello sviluppo normale e malattia.