Basale cellen als stamcellen van de muis trachea en de menselijke luchtwegen epitheel

RNA van alle 3 fracties werd geanalyseerd door Affymetrix microarray. Clustering van de 100 meest differentieel gereguleerde genen tussen de fracties toonde een goede correlatie tussen de replicaten (Fig. 2C). De genen die het meest tot expressie kwamen in de niet-BC populatie omvatten diegene die geassocieerd worden met gecilieerde en secretorische cellen (Tabel S3). Zoals verwacht, een aantal van de genen geupreguleerd in de lectine +;KRT5-GFP- populatie zijn geassocieerd met dendritische cellen. In de toekomst zullen nieuwe strategieën worden gebruikt om de dendritische cellen uit deze BC fractie te verwijderen. We vonden 627 genen geupreguleerd ten minste 21,5-voudig in de lectine +;KRT5-GFP + BCs in vergelijking met niet-BCs (P ≤ 0,001) (Tabel S4 en Tabel S5). De geldigheid van het scherm werd op verschillende manieren bevestigd. Ten eerste, RT-PCR bevestigde de verrijking van transcripten in KRT5-GFPhi BCs (Fig. 2D). Ten tweede, gepubliceerde rapporten bevestigd expressie van een aantal verrijkte genen in BCs van muizen trachea en / of de menselijke luchtwegen. Voorbeelden hiervan zijn genen coderen Trp-63, die nodig is voor BC ontwikkeling in de muis luchtpijp (2), Snai2, Cd109, claudin 1, Icam1, aquaporine 3, en keratines 5, 14, en 17 (3, 17-21). Ten slotte, immunohistochemie op secties van muizentrachea en normale menselijke bronchus bevestigd BC expressie van verschillende genen, waaronder Ngfr (zie hieronder).

De genen geupreguleerd in lectine +;KRT5-GFPhi BCs werden gesorteerd in functionele categorieën (tabel S4). Die geassocieerd met celadhesie omvatten genen die coderen voor componenten van hemidesmosomen en verankering fibrillen-integrins α6 en β4, laminines α3 en β3, dystonine (BPAG1), en collageen 17a1 (BPAG2) (22). Dit weerspiegelt de overvloedige hemidesmosomale aanhechtingen van BCs aan de onderliggende basale lamina (1). Onze resultaten suggereren ook dat BCs componenten van het ECM produceren, waaronder fibuline1, fibrilline2, Tnc, collageen18a1, Sparc, en TGFβ-geïnduceerd. Ze zijn ook verrijkt voor cytoskeletale componenten die de membraanorganisatie, vorm en motiliteit beïnvloeden. Transcriptiefactoren die worden geupreguleerd in KRT5-GFP+ BCs zijn Snai2 (Slug) en zijn corepressor, ajuba (Jub), basonuclin, Lmo1, Tbx2, Barx2, Etv4, Hlf, AP-2 epsilon, Myc, en Ascl2.

Tracheale BCs zijn normaal gesproken relatief rustig maar reageren snel op verwonding. Zowel rust als activering worden waarschijnlijk gereguleerd door wederzijdse signalering tussen BCs en hun niche. Transcripten voor verschillende signaal liganden (Bmp7, delta-like 1 en 2, jagged2, Ccl20, PdgfC, pleiotrophin, Tgfb1, Ntf3, Wnt3a, Wnt5b, en Wnt9a) en receptoren (Notch1, Gfra1, Ngfr, Ptch2, Egfr, Tgfbr3, ephrin receptor B4, en verschillende G protein-coupled receptoren) werden verrijkt in deze BC subpopulatie. Bovendien werden antagonisten van intercellulaire signaalwegen (Socs3, sprouty1, Sfrp1, Dkk3, follistatin-like1, follistatin-like3, Ppp2r2c, en latent TGFβ bindend eiwit 4) ook opgehoogd.

De snelle proliferatieve reactie van BCs op epitheliale verwonding suggereert dat, hoewel ze normaal relatief rustig zijn, ze klaar zijn om te reageren op activerende stimuli. Dit kenmerk is niet uniek voor respiratoire BCs. Zo ondergaan stamcellen in systemen die cycli van groei, vernietiging, rust en hergroei ondergaan (b.v. de borstklier en de haarfollikel) gelijkaardige fenotypische veranderingen van rust naar activering. Het is daarom van groot belang dat een aantal genen die tot expressie komen in stamcellen van de haarfollikel uitstulping en de borstklier, inclusief transcriptiefactoren, componenten van de ECM, signaal liganden, receptoren, en, belangrijk, negatieve regulatoren van intercellulaire signalering, ook tot expressie komen in tracheale BCs (23, 24). Veel van deze eiwitten controleren waarschijnlijk stamcel-niche interacties en, mogelijk, het vermogen van BCs om te reageren op activerende stimuli.

Het feit dat BCs verschillende verhoudingen van gecilieerde en Clara cellen genereren bij steady state versus herstel na letsel (tabel 1) suggereert dat progeny cel fates worden beïnvloed door lokale weefselomstandigheden. Dit concept is voorgesteld voor de Drosophila middendarm, waar variërende niveaus van Notch ligand in de intestinale stamcellen regelt het lot van hun nakomelingen (25, 26). Veelzeggend is dat BCs verrijkt zijn met transcripten van de Notch pathway (b.v. Notch1, Dll1, en Jag2). Toekomstige studies zullen hun functie in BCs.

Nieuwe Assay voor zelfvernieuwing en differentiatie van BCs.

Vorige assays voor het potentieel van tracheale BCs om te prolifereren en te differentiëren omvatten repopulatie van gedenuded tracheale xenograften en lucht-vloeistof-interface (ALI) cultuur. Geen van beide is ideaal voor kwantitatieve analyse, omdat xenograft modellen zijn low-throughput, en we vonden het moeilijk om reproduceerbaar BCs differentiëren op de ALI in de afwezigheid van niet-BCs. Daarom hebben we 3-dimensionale bol-vormende assays van andere stamcelpopulaties aangepast voor de expansie en differentiatie van BCs. Wanneer enkele, levensvatbare KRT5-GFP + tracheale BCs werden gezaaid in deze test, “tracheosferen” met een zichtbaar lumen gevormd binnen 1 week, zelfs in de afwezigheid van stroma of niet-BCs (Fig. 3 A en B). De bol-vormende efficiëntie was ≈3% van de uitgezette KRT5-GFP + cellen. Ter vergelijking, de kolonie-vormende efficiëntie van KRT5-GFP + cellen in 2-dimensionale ALI cultuur in combinatie met een 500-voudige overmaat van KRT5-GFP- cellen was 5% (3). Ongeveer 0,5% van de KRT5-GFP- cellen, waarschijnlijk KRT5-GFP- BC’s, vormden bollen histologisch niet te onderscheiden van de KRT5-GFP + BC-afgeleide bollen (Fig. 3C en Tabel S6).

Tegen 9 dagen van de cultuur, zagen we tracheosferen met diameters variërend van <50 pm tot >300 pm, wat suggereert dat heterogeniteit bestaat binnen de bol-vormende bevolking (Fig. S3 en Tabel S7). Zelden werden gelobde kolonies waargenomen, maar deze kolonies niet overleven op de lange termijn en hebben dus een beperkte capaciteit voor zelfvernieuwing in deze test. Op dag 9, tracheosferen bestond uit een pseudo-gestratificeerde epitheel met p63 +, KRT14 + BCs perifere luminale KRT8 + cellen (Fig. 3 D en E). Op dag 20, had overlevende bollen ondergaan luminale uitbreiding en een dunner worden van de pseudostratified epitheel, en kloppende cilia werden waargenomen. Dit werd bevestigd door antilichaamkleuring voor geacetyleerd tubuline (Fig. 3G). In 26-dagen bolletjes het percentage KRT8 + zuilvormige cellen die gecilieerd (≈50%) was ongeveer hetzelfde als in volwassen wild-type muis trachea’s. Niet-gekartelde KRT8 + cellen bleven in bolletjes, maar niet tot expressie markers van Clara (Scgb1a1), neuro-endocriene (CGRP), of slijm-producerende (Muc5AC) cellen op niveaus detecteerbaar door immunohistochemie op 9 of 20 dagen van cultuur. Bovendien brachten zeer weinig cellen claudine 10 tot expressie. Verdere experimenten zijn nodig om dit zuilvormige celtype te identificeren en om de condities voor de differentiatie van rijpe secretorische cellen van BC progenitors te optimaliseren. BCs in bolletjes behielden expressie van KRT5-GFP tot tenminste P21 dagen. Om het zelfvernieuwingspotentieel van BCs verder aan te tonen, hebben we KRT5-GFP + cellen van bollen twee keer serieel gekweekt op het moment van indiening.

Voor brede toepassing van de tracheosphere assay, is het belangrijk om BCs onafhankelijk van een transgen te kunnen isoleren. Onze transcriptoom analyse bleek dat Ngfr (p75, Tnfrsf16), een lid van de TNF-receptor superfamilie, is verrijkt in tracheale BCs (tabel S4). Veelzeggend is dat dit gen ook tot expressie komt in basale/basale-achtige cellen van andere epithelia, waaronder slokdarm, hoornvlies limbus, en borstklier (28-30). Ntf3, dat codeert voor een ligand voor NGFR, is ook verrijkt in tracheale BCs van muizen (Tabel S5), wat de mogelijkheid oproept van autocriene signalering binnen deze populatie. Immunohistochemie toonde aan dat NGFR specifiek is gelokaliseerd op 98% van p63 + muis BCs (Fig. 4A). Daarom gebruikten we een NGFR antilichaam om tracheale epitheelcellen te sorteren in basale en niet-basale populaties (Fig. 4B). Na FACS, 86% van de NGFR + cellen waren p63 +, terwijl <1% van de NGFR- cellen uitdrukken p63. De bolvormende efficiëntie van NGFR + BCs was ≈4%, terwijl ≈0,05% NGFR- cellen aanleiding gaven tot bollen (tabel S6). Deze bevinding suggereert dat, hoewel een subset van BCs in staat is tot zelfvernieuwing en differentiatie onder deze omstandigheden, het vermogen van BC-verlaagde populaties om dit te doen aanzienlijk is verminderd. In feite, omdat 4% van de BC’s bolletjes genereren en ≈1% van de NGFR-cellen p63+ BC’s zijn, is de 0,05% bolletjesvormende efficiëntie in de NGFR-populatie mogelijk toe te schrijven aan BC’s. Bolletjes afkomstig van NGFR+ cellen waren histologisch hetzelfde als die afkomstig van KRT5-GFP+ cellen. Bovendien, wanneer NGFR+ BCs van constitutief GFP-exponderende of RFP-exponderende muizen werden gemengd na het sorteren, fluoresceerden alle bolletjes rood of groen (Fig. S3D). Deze bevinding suggereert dat bollen zijn afgeleid van enkele NGFR + BCs.

BCs van de menselijke long.

In de mens, p63 + cellen met de morfologie van BCs worden gevonden in de long, hoewel aantallen distaal afnemen (1, 4, 5). Deze cellen brengen een aantal genen tot expressie die verrijkt zijn in muis BCs, waaronder NGFR (Fig. 4C). Om onze in vitro assay toe te passen op menselijke BCs, isoleerden wij totale epitheelcellen van menselijke bronchiën en kweekten deze ’s nachts om te verrijken voor p63+ cellen. Onze transcriptoom analyse van muis BCs bleek dat Itga6 bij voorkeur wordt uitgedrukt in tracheale BCs. Daarom sorteerden we menselijke long epitheelcellen door FACS met NGFR en ITGA6 antilichamen (Fig. 4D). Onder deze omstandigheden, ≈96% van de ITGA6 +; NGFR + fractie was p63 +, terwijl slechts ≈15% van de ITGA6-;NGFR- cellen uitgedrukt p63. Wanneer gezaaid in de test, ITGA6 + + NGFR + BCs gaf aanleiding tot “bronchospheres” op dag 10, met een enkel lumen dat uitbreiding onderging meer dan 20 dagen van de cultuur (Fig. 4 E-I en Tabel S8). Zeer weinig kolonies gevormd uit de ITGA6-;NGFR- cellen. Bolletjes bevatten KRT14+, p63+ BCs perifeer aan KRT8+ luminale cellen, en gecilieerde cellen werden waargenomen binnen 25 dagen van cultuur. Deze bevindingen suggereren dat menselijke BCs in staat zijn tot zowel zelfvernieuwing als de generatie van gedifferentieerde dochters.

Concluderend hebben we in vivo aangetoond dat BCs van de muizentrachea functioneren als progenitorcellen zowel tijdens postnatale groei als in de volwassene bij steady state en in een herstelmodel. Met behulp van een klonale test hebben we aangetoond dat BCs van zowel muizen als menselijke luchtwegen zichzelf kunnen vernieuwen en differentiëren in afwezigheid van stroma of zuilvormige epitheelcellen. Deze assay zal de studie vergemakkelijken van mechanismen die de ontwikkeling, het onderhoud en het herstel van het luchtwegepitheel reguleren. Tenslotte hebben we een transcriptioneel profiel van muizen BCs afgeleid dat toekomstige onderzoeken naar de fenotypische controle van deze belangrijke stamcelpopulatie in zowel normale ontwikkeling als ziekte zal informeren.