Komórki podstawne jako komórki macierzyste mysiej tchawicy i ludzkiego nabłonka dróg oddechowych

During postnatal growth there is an increase in the length and diameter of the rodent trachea and in the number of epithelial cells, including BCs (1). W poprzednich badaniach wykazaliśmy znakowanie BrdU komórek nabłonka tchawicy w postnatalnych (P)6 dniach, P3 tygodniach i P6 miesiącach (13). Dalsza analiza materiału wykazała, że 55% p63+ BCs i 10% non-BCs jest znakowanych BrdU w P6 dniu, podczas gdy odpowiednie wartości dla P3 tygodnia wynosiły 9% BCs i 2% non-BCs (Fig. S1). Aby śledzić zachowanie BCs tchawicy podczas wzrostu postnatalnego, kohorta myszy KRT5-CreERT2;Rosa26R-eYFP otrzymała impuls Tmx w P10 dniach lub P12 dniach (Figura 1G). W wieku P3 tygodni większość (96%) komórek znakowanych liniowo stanowiły BC (Fig. 1H i Tabela S1). Stanowiły one 7% ± 3% wszystkich BC w tchawicy (Tabela S2). Ten odsetek pozostał w przybliżeniu taki sam, gdy członkowie kohorty byli badani w P6 tygodniu i w P15 tygodniu, co sugeruje, że znakowane BCs samoodnawiają się i nie są rozcieńczane przez potomków nieznakowanych komórek. Podobnie jak poprzednio, nastąpił wzrost w czasie odsetka znakowanych komórek ocenianych jako komórki Clara lub komórki rzęskowe (Fig. 1I i Tabela S1). Tak więc, podczas wzrostu postnatalnego BCs zarówno samoodnawiają się, jak i dają początek komórkom Clara i ciliated.

Wreszcie, śledziliśmy losy oznakowanych BCs w modelu naprawczym. Inhalacja SO2 prowadzi do rozległych uszkodzeń nabłonka tchawicy, po których następuje proliferacja ocalałych komórek i przywrócenie normalnej histologii do 2 tygodni (14). Podczas procesu naprawczego, znakowane BC proliferują i dają początek stosunkowo dużym płatom komórek potomnych, które obejmują Clara i komórki rzęskowe (Fig. S2). W przeciwieństwie do wyników w stanie ustalonym, BC reagujące na uraz dają początek większej liczbie komórek rzęskowych niż komórek Clara w tym samym okresie (Tabela 1). Sugeruje to, że losy córek BC mogą się różnić w odpowiedzi na warunki lokalne.

Profil transkrypcyjny tchawiczych BCs.

Aby oddzielić BCs od komórek kolumnowych do profilowania transkrypcyjnego, najpierw posortowaliśmy komórki na podstawie wiązania fluorescencyjnie znakowanej izolektyny A3B Griffonia simplicifolia (GSI-A3B), która wiąże wszystkie BCs (3, 10, 15). Wiąże ona również populację komórek dendrytycznych obecnych w obrębie nabłonka (16). Dalej oczyszczaliśmy komórki lektyny+ na podstawie ekspresji GFP, wykorzystując wcześniej opisaną transgeniczną linię myszy KRT5-GFP, w której GFP ulega ekspresji na wysokim poziomie w około 60% p63+ BC tchawicy (3). Komórki lectin+;KRT5-GFP+ (P4) były zasadniczo czystą subpopulacją BC, ponieważ >90% wykazuje ekspresję p63. Natomiast populacja lectin-;KRT5-GFP- (dalej non-BC) (P5) zawierała bardzo niewiele komórek p63+. Komórki lectin+;KRT5-GFP- (P6) zawierały zarówno komórki podstawne, jak i dendrytyczne (ryc. 2 A i B).

RNA ze wszystkich 3 frakcji analizowano za pomocą mikromacierzy Affymetrix. Klasteryzacja 100 najbardziej różnie regulowanych genów pomiędzy frakcjami wykazała dobrą korelację pomiędzy replikami (Rys. 2C). Wśród genów ulegających największej ekspresji w populacji non-BC znalazły się te związane z komórkami rzęskowymi i wydzielniczymi (Tabela S3). Zgodnie z oczekiwaniami, niektóre z genów ulegających ekspresji w populacji lektyna+;KRT5-GFP- są związane z komórkami dendrytycznymi. W przyszłości zostaną zastosowane nowe strategie w celu usunięcia komórek dendrytycznych z tej frakcji BC. Stwierdziliśmy, że 627 genów uległo co najmniej 21,5-krotnej ekspresji w BC lektyna+;KRT5-GFP+ w porównaniu z nie-BC (P ≤ 0,001) (Tabela S4 i Tabela S5). Poprawność badania została potwierdzona na kilka sposobów. Po pierwsze, RT-PCR potwierdziła wzbogacenie transkryptów w KRT5-GFPhi BCs (Fig. 2D). Po drugie, opublikowane doniesienia potwierdziły ekspresję kilku wzbogaconych genów w BCs tchawicy myszy i/lub ludzkich dróg oddechowych. Przykłady obejmują geny kodujące Trp-63, który jest wymagany do rozwoju BC w tchawicy myszy (2), Snai2, Cd109, klaudynę 1, Icam1, akwaporynę 3 oraz keratyny 5, 14 i 17 (3, 17-21). Wreszcie, immunohistochemia na wycinkach tchawicy myszy i normalnego ludzkiego oskrzela potwierdziła ekspresję BC kilku genów, w tym Ngfr (patrz poniżej).

Geny wyregulowane w lektynie+;KRT5-GFPhi BCs zostały posortowane w kategorie funkcjonalne (Tabela S4). Te związane z adhezją komórek obejmują geny kodujące składniki hemidesmosomów i fibryli kotwiczących – integryny α6 i β4, lamininy α3 i β3, dystoninę (BPAG1) i kolagen 17a1 (BPAG2) (22). Odzwierciedla to obfite hemidesmosomalne przyłączenia BCs do leżącej u ich podłoża blaszki podstawnej (1). Nasze wyniki sugerują również, że BCs produkują składniki ECM, w tym fibulinę1, fibrylinę2, Tnc, kolagen18a1, Sparc oraz indukowane przez TGFβ. Są one również wzbogacone w składniki cytoszkieletu, które wpływają na organizację błon, kształt i ruchliwość. Czynniki transkrypcyjne, które są podwyższone w KRT5-GFP+ BCs obejmują Snai2 (Slug) i jego represor, ajuba (Jub), basonuclin, Lmo1, Tbx2, Barx2, Etv4, Hlf, AP-2 epsilon, Myc i Ascl2.

Tracheal BCs są normalnie stosunkowo spokojne, ale szybko reagują na uraz. Zarówno quiescence jak i aktywacja są prawdopodobnie regulowane przez wzajemną sygnalizację pomiędzy BCs i ich niszą. Transkrypty dla różnych ligandów sygnalizacyjnych (Bmp7, delta-like 1 i 2, jagged2, Ccl20, PdgfC, plejotropina, Tgfb1, Ntf3, Wnt3a, Wnt5b i Wnt9a) i receptorów (Notch1, Gfra1, Ngfr, Ptch2, Egfr, Tgfbr3, receptor efryny B4 i kilka receptorów sprzężonych z białkami G) były wzbogacone w tej subpopulacji BC. Ponadto, antagoniści międzykomórkowych szlaków sygnałowych (Socs3, sprouty1, Sfrp1, Dkk3, follistatin-like1, follistatin-like3, Ppp2r2c, i latent TGFβ binding protein 4) również były podwyższone.

Gwałtowna odpowiedź proliferacyjna BCs na uraz nabłonka sugeruje, że chociaż normalnie są one stosunkowo spokojne, są gotowe do odpowiedzi na bodźce aktywujące. Ta cecha nie jest unikalna dla BC układu oddechowego. Na przykład, komórki macierzyste w systemach, które przechodzą cykle wzrostu, zniszczenia, odpoczynku i odrastania (np. gruczoł sutkowy i mieszek włosowy) przechodzą podobne fenotypowe przełączenia od stanu spoczynku do aktywacji. Jest zatem bardzo interesujące, że szereg genów ulegających ekspresji w komórkach macierzystych mieszka włosowego i gruczołu sutkowego, w tym czynniki transkrypcyjne, składniki ECM, ligandy sygnalizacyjne, receptory i, co ważne, negatywne regulatory sygnalizacji międzykomórkowej, ulegają ekspresji również w BC tchawicy (23, 24). Wiele z tych białek prawdopodobnie kontroluje interakcje komórka macierzysta-niche i, potencjalnie, zdolność BCs do odpowiedzi na bodźce aktywujące.

Fakt, że BCs generują różne proporcje komórek rzęskowych i Clara w stanie ustalonym vs. naprawa po urazie (Tabela 1) sugeruje, że na losy komórek potomnych mają wpływ lokalne warunki tkankowe. Koncepcja ta została zaproponowana dla jelita środkowego Drosophila, gdzie zróżnicowany poziom ligandu Notch w jelitowych komórkach macierzystych reguluje losy ich potomstwa (25, 26). Co istotne, BCs są wzbogacone w transkrypty szlaku Notch (np. Notch1, Dll1 i Jag2). Przyszłe badania określą ich funkcję w BCs.

Nowatorski test na samoodnawianie i różnicowanie BCs.

Poprzednie testy na potencjał BCs tchawicy do proliferacji i różnicowania obejmują ponowne zasiedlanie uszkodzonych ksenograftów tchawicy i hodowlę interfejsu powietrze-ciecz (ALI). Żadna z tych metod nie jest idealna do analizy ilościowej, ponieważ modele ksenograftów są mało wydajne, a my stwierdziliśmy, że trudno jest odtwarzać różnicowanie BC w ALI przy braku nie-BCs. Dlatego zaadaptowaliśmy trójwymiarowe testy formowania kul z innych populacji komórek macierzystych do ekspansji i różnicowania BCs. Kiedy pojedyncze, zdolne do życia KRT5-GFP+ BCs tchawicy zostały zasiane w tym teście, „tracheosfery” z widocznym światłem uformowały się w ciągu 1 tygodnia, nawet przy braku zrębu lub nie-BCs (Fig. 3 A i B). Wydajność tworzenia sfer wynosiła ≈3% komórek KRT5-GFP+ umieszczonych na płytce. Dla porównania, wydajność tworzenia kolonii z komórek KRT5-GFP+ w dwuwymiarowej hodowli ALI w połączeniu z 500-krotnym nadmiarem komórek KRT5-GFP- wynosiła 5% (3). Około 0,5% komórek KRT5-GFP-, prawdopodobnie KRT5-GFP- BCs, tworzyło sfery histologicznie nieodróżnialne od sfer pochodzących z KRT5-GFP+ BC (Figura 3C i Tabela S6).

Do 9 dnia hodowli obserwowaliśmy tracheosfery o średnicy od <50 μm do >300 μm, sugerując, że heterogeniczność istnieje w obrębie populacji tworzącej sfery (Figura S3 i Tabela S7). Rzadko obserwowano kolonie z płatami, ale te kolonie nie przetrwały przez długi czas, a zatem mają ograniczoną zdolność do samoodnowy w tym teście. Do 9. dnia tracheosfery składały się z pseudostratyfikowanego nabłonka z p63+, KRT14+ BCs peryferyjnie do luminalnych komórek KRT8+ (Fig. 3 D i E). Do 20. dnia życia w przetrwałych sferach nastąpiło rozszerzenie luminalne i ścieńczenie nabłonka pseudostratyfikacyjnego oraz zaobserwowano bijące rzęski. Potwierdzono to barwieniem przeciwciałami na acetylowaną tubulinę (ryc. 3G). W 26-dniowych kuleczkach odsetek komórek kolumnowych KRT8+, które miały rzęski (≈50%) był w przybliżeniu taki sam jak w tchawicy dorosłej myszy typu dzikiego. Niewydzielone komórki KRT8+ utrzymywały się w sferach, ale nie wykazywały ekspresji markerów komórek Clara (Scgb1a1), neuroendokrynnych (CGRP) lub produkujących śluz (Muc5AC) na poziomach wykrywalnych immunohistochemicznie po 9 lub 20 dniach hodowli. Ponadto, bardzo niewiele komórek wykazywało ekspresję klaudyny 10. Konieczne są dalsze eksperymenty w celu zidentyfikowania tego kolumnowego typu komórek i optymalizacji warunków różnicowania dojrzałych komórek wydzielniczych z progenitorów BC. BC w sferach utrzymywały ekspresję KRT5-GFP co najmniej do P21 dni. Aby dodatkowo wykazać potencjał samoodnowy BCs, seryjnie subkulturowaliśmy komórki KRT5-GFP+ ze sfer dwukrotnie w czasie składania.

Dla szerokiego zastosowania testu tracheosfery ważne jest, aby móc wyizolować BCs niezależnie od jakiegokolwiek transgenu. Nasza analiza transkryptomu ujawniła, że Ngfr (p75, Tnfrsf16), członek nadrodziny receptorów TNF, jest wzbogacony w BC tchawicy (Tabela S4). Co istotne, gen ten ulega ekspresji również w komórkach podstawnych/podstawnych innych nabłonków, w tym przełyku, limbium rogówki i gruczołu sutkowego (28-30). Ntf3, kodujący ligand dla NGFR, jest również wzbogacony w BC tchawicy myszy (Tabela S5), podnosząc możliwość sygnalizacji autokrynnej w tej populacji. Immunohistochemia wykazała, że NGFR jest specyficznie zlokalizowany w 98% p63+ mysich BCs (Fig. 4A). Dlatego użyliśmy przeciwciała NGFR do sortowania komórek nabłonka tchawicy na populacje podstawne i niepodstawne (Fig. 4B). Po FACS, 86% komórek NGFR+ było p63+, podczas gdy <1% komórek NGFR- wykazuje ekspresję p63. Wydajność sferotwórcza NGFR+ BCs wynosiła ≈4%, podczas gdy ≈0,05% komórek NGFR- dało początek sferom (Tabela S6). To odkrycie sugeruje, że chociaż podzbiór BC jest zdolny do samoodnawiania i różnicowania się w tych warunkach, zdolność populacji pozbawionych BC do tego jest znacznie zmniejszona. W rzeczywistości, ponieważ 4% BCs generuje sfery, a ≈1% komórek NGFR- to p63+ BCs, wydajność tworzenia sfer w populacji NGFR- wynosząca 0,05% jest potencjalnie przypisywana BCs. Sfery uzyskane z komórek NGFR+ były histologicznie takie same jak te uzyskane z komórek KRT5-GFP+. Ponadto, gdy po sortowaniu wymieszano BCs NGFR+ od myszy konstytutywnie wykazujących ekspresję GFP lub RFP, wszystkie kule fluoryzowały na czerwono lub zielono (Fig. S3D). To odkrycie sugeruje, że kule pochodzą z pojedynczych NGFR+ BCs.

BCs of the Human Lung.

W ludziach, komórki p63+ o morfologii BCs występują w całym płucu, chociaż ich liczba zmniejsza się dystalnie (1, 4, 5). Komórki te wykazują ekspresję szeregu genów wzbogaconych w mysie BC, w tym NGFR (ryc. 4C). Aby zastosować nasze badanie in vitro do ludzkich BCs, wyizolowaliśmy całkowite komórki nabłonkowe z ludzkich oskrzeli i hodowaliśmy je przez noc w celu wzbogacenia ich w komórki p63+. Nasza analiza transkryptomu mysich BCs wykazała, że Itga6 ulega preferencyjnej ekspresji w BCs tchawicy. Dlatego posortowaliśmy ludzkie komórki nabłonka płuc przez FACS używając przeciwciał NGFR i ITGA6 (Fig. 4D). W tych warunkach ≈96% frakcji ITGA6+;NGFR+ wykazywało ekspresję p63+, podczas gdy tylko ≈15% komórek ITGA6-;NGFR- wykazywało ekspresję p63. Po zasianiu w teście, BCs ITGA6+;NGFR+ dały początek „bronchosferom” w 10. dniu, z pojedynczym światłem, które ulegało ekspansji przez 20 dni hodowli (ryc. 4 E-I i tabela S8). Z komórek ITGA6-;NGFR- powstało bardzo niewiele kolonii. Kule zawierały KRT14+, p63+ BCs peryferyjnie do komórek luminalnych KRT8+, a komórki rzęskowe były obserwowane w ciągu 25 dni hodowli. Wyniki te sugerują, że ludzkie BCs są zdolne zarówno do samoodnawiania, jak i generowania zróżnicowanych córek.

Podsumowując, wykazaliśmy in vivo, że BCs tchawicy myszy funkcjonują jako komórki progenitorowe zarówno podczas wzrostu postnatalnego, jak i u dorosłych w stanie ustalonym i w modelu naprawczym. Używając testu klonalnego, wykazaliśmy, że BCs zarówno mysich, jak i ludzkich dróg oddechowych mogą się samoodnawiać i różnicować przy braku zrębu lub komórek nabłonka kolumnowego. Test ten ułatwi badanie mechanizmów regulujących rozwój, utrzymanie i naprawę nabłonka dróg oddechowych. Wreszcie, uzyskaliśmy profil transkrypcyjny mysich BCs, który będzie informował o przyszłych badaniach nad fenotypową kontrolą tej ważnej populacji komórek macierzystych zarówno w normalnym rozwoju, jak i w chorobie.

.